Post XXV dies incubationis staticae ad XXVIII°C, laccasum ex *Pleuroto ostreato* NRC620 maximam activitatem in medio culturae fungalis ostendit. Valores pH et temperaturae optimi pro hoc enzymo erant 3.0 et 70°C respective. Post duas horas incubationis ad XL°C et L°C, activitas enzymi 68.33% et 59.61% respective retinuit. Post duas horas incubationis in solutione citrato-phosphato (pH 7.0), activitas enzymi ad C% remansit. Additio 10 mM MgSO₄ et CuSO₄ activitatem enzymi circiter XXI% et XXXV% respective auxit, dum NaCl, MnCl₂, KCl, et CaCl₂ activitatem enzymi inhibuerunt. Adhibito ABTS ut substrato, parametri cinetici (Km et Vmax) laccasae *Pleurotus ostreatus* NRC 620 erant 1.99 mM et 16,217 μmol min⁻¹ L⁻¹ respective. Curatio enzymatica exemplorum suci mali significanter et pH et viscositatem minuit, et haec reductio cum incremento temporis repositionis correlata est. Curatio laccasae levem diminutionem in contento phenolico totali suci mali effecit, sed nulla reductio in activitate antioxidante observata est.
Recentibus annis, investigatores in applicationem biotechnologiae viridis in industria alimentaria operam dederunt. Laccase est unum ex utilissimis enzymis in industria alimentaria, applicationes inveniens in campis ut succi tractandi, pistoria faciendi, stabilizandi vini, et qualitates organolepticas productorum alimentariorum emendandis.1Multae plantae superiores et microorganismi laccasem secernunt,2et fungi ut deuteromycetes, ascomycetes, et basidiomycetes etiam laccasem producere possunt.3Laccasa (EC 1.10.3.2) est oxidasa caerulea quae oxygenium moleculare ad aquam reducit, systemate tribus atomis cupri diversis constanti utens, ita varia composita phenolica et aminas aromaticas oxidans. In productione succorum fructuum et olerum, fuscescentia enzymatica et nonenzymatica res criticae sunt.4Quoniam hae substantiae colorem, saporem et odorem succi negative afficiunt, removendae sunt.5
Ex omnibus fructibus, mala sunt maxime consumpta in toto orbe terrarum et in Unione Europaea. Anno MMXIX, productio malorum tertium locum in mundo tenuit, plus quam LXXXVII miliones tonnarum.6Mala multa composita phenolica continent, inter quae flavonoida et acida phenolica, ut acidum caffeicum et acidum chlorogenicum.7Quia succus pomorum plerumque in forma clara consumitur, circiter 50% ad 90% componentium phenolicorum per filtrationem amittuntur.8Hodie, emptores solent eligere res minimaliter confectas, ut sucum pomorum turbidum cum alto contento polyphenolorum. Attamen, propter altum contentum phenolicum, hoc genus suci pomorum praecipue obnoxium est ad decolorationem et obscurationem.9Variae technologiae, inter quas modi curationis caloris ut pasteurizatio ad 60–90°C, adhibentur ad obscurationem suci malorum reducendam vel prohibendam.10Tamen secundum investigationem in Sauceda-Gálvez11, processus thermalis substantias chemicas volatiles delere et qualitates organolepticas suci pomorum afficere potest. Alternativae methodis processus thermalis includunt dioxidum carbonis supercriticum, radiationem ultraviolaceae, ultrasonum, pressionem hydrostaticam altam, vel homogenizationem sub alta pressione.12Efficacia harum technologiarum et proventus succorum fructuum idoneorum a parametris adhibitis et proprietatibus productorum pendent. Usus earum late diffusus sumptibus altis, effectibus adversis in qualitatem quorundam productorum cibariorum, aut inactivatione enzymorum insufficiens limitatur.13,14
Laccasum ad succum fructuum stabiliendum et clarificandum adhiberi potest.15Gökmen et alii.16Laccasa ad clarificationem succi fructuum commendatur, quia composita phenolica efficaciter removet, ea in polymera vel oligomera convertendo, quae facile per quamlibet membranam ultrafiltrationis removentur, permittens succum mali colorem et claritatem stabilem usque ad sex septimanas ad 50°C conservare. Laccasa *Trichodermae* purificata in globulis aluminae immobilizata est et adhibita est ad selective removenda composita sapore iniquo causata a contaminatione microbiali succi mali.17
Circiter octoginta ad nonaginta centesimae partium volatilium suci pomorum sunt esteres et aldehyda, quae aroma singulare suco impertiunt.18Laccasa ex *Trametes versicolor* in supporto vili ex fibra naturali e putaminibus cocois iuvenibus factum ad clarificandum sucum pomorum immobilizata est.19Studia priora stabilizationem succi malorum (colorem et turbiditatem) per methodos sine enzymis vel immobilizationis, vel in combinatione cum ultrafiltratione, investigaverunt.5,19Attamen effectus laccasarum fungalium in proprietates physico-chemicas succi mali durante conservatione adhuc incertus manet. Quapropter, propositum huius studii fuit experimentaliter investigare mutationes in proprietatibus physico-chemicis, contento compositorum phenolicorum, et actione antioxidante succi mali post tractationem laccasis fungalibus et duas hebdomadas conservationis refrigeratae. Laccasae facultatem habent composita phenolica oxidandi, quod eas promittentes reddit ad usum in variis processibus industrialibus, incluso clarificatione succi. Hoc studium laccasas ex *Pleuroto ostreato* NRC 620 examinavit, in condicionibus idealibus pro earum actione et efficacia in clarificatione succi intendens. Dum investigatio in fungos ostreatos (P. ostreatus NRC 620) adhuc limitata est, studia priora enzyma ex variis fontibus fungalibus, ut Trametes versicolor et Ganoderma lucidum, examinaverunt. Propositum huius studii fuit potentialem applicationem huius enzymi in industria alimentaria aestimare et proprietates eius singulares, praesertim pH et temperatura ideales, illustrare.
Acidum 2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonicum) (ABTS) a Sigma-Aldrich (Canada) emptum est. Cetera omnia reagentia gradus analytici erant.
Centrum Collectionis Culturae Microbicae Centri Investigationis Nationalis stirpem fungorum ostreae notam NRC620 obtinuit. Post subculturam, haec stirps in vasculis inclinatis agaro-dextrosati cum solano ad 4°C conservata est. Methodus praeparationis inoculi haec erat: mycelium decem dierum natum, plene evolutum, in laminas agaro-dextrosati cum solano inoculatum et ad 28°C incubatum est. Post decem dies, tres frusta mycelii 12 mm diametro e medio agaro, instrumento metallico sterili utentes, remota sunt et in ampullis Erlenmeyer 250 mL cum obturaculis gossypii continentibus 50 mL medii culturae sterilis (pH 5.0, ut antea ab Othman et al. descriptum est) posita sunt.20Culturae ad 28°C per 18 dies incubatae sunt. Deinde culturae per chartam filtratoriam Whatman No. 1 filtratae sunt, et supernatans inde resultans fons enzymi fuit.
Actio laccase determinata est ABTS ut substratum adhibito. Mixtura reactionis (2 mL) continebat 500 μL 0.3 mM ABTS (dissoluti in 0.1 M solutione tampone natrii citratis, pH 4.5) et quantitatem requisitam exempli enzymi aqua destillata diluti.XXI, XXIICum laccasum ABTS temperatura ambiente (28°C ± 2) oxidare possit, oxidatio ABTS determinata est mensurando augmentum absorptionis ad 420 nm (ε₀).420= 36,000 cm³-1 M -1) utens spectrophotometro Agilent Carry-100 UV. Una unitas activitatis laccase necessaria erat ad oxidandum 1 μmol ABTS per minutum. Concentratio proteini determinata est methodo Bradford adhibita albumine serico bovino ut moderatore interno.XXIII, XXIV
Postquam enzymum ex stirpe fungi ostreae NRC 620 obtentum est, eius activitas variis intervallis culturae per 25 dies sub condicionibus staticis ad 28°C mensurata est.
Ad effectum temperaturae in actionem laccasarum investigandum, experimenta in intervallo temperaturae a 20 ad 90°C peracta sunt. Antequam enzymum adderetur et reactio inciperetur, liquor tamponatus (0.1 M natrii citras, pH 4.5) et substratum (ABTS) mixta et per 5 minuta variis temperaturis incubata sunt. Stabilitas thermalis enzymi aestimata est incubatione in 0.05 M natrii phosphatis tamponato (pH 7.0) ad 40, 50, 60, et 70°C per 2 horas, respective. Actio residua deinde aestimata est utens substrato ABTS.
Effectus pH in actionem laccasis aestimatus est utens ABTS ut substrato in 0.1 M citratis-phosphatis tamponibus cum pH ambitu 2.5 ad 7.0. Solutio enzymi ad 40°C per duas horas incubata est in 0.1 M citratis et Tris tamponibus (pH 3, 4, 6, et 7) ad stabilitatem pH aestimandam. Actio residua cum ABTS ut substrato post incubationem calculata est.
Laccasa per decem minuta in sodio phosphato tamponato (0.05 M, pH 7.0) incubata est, variis ionibus metallicis (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, et Mn2+) continentibus concentrationibus 2.5 mM et 10 mM respective. Deinde substratum (ABTS) additum est ad reactionem incipiendam, et activitas relativa aestimata est.
Oxidatio ABTS per laccasem variis concentrationibus (0.025–3 mM) ad pH 4.5 mensurata est ad parametros cineticos (Vmax et Km) determinandos. Concentratio cinetica...constantesAequationis Michaelis-Menten per diagramma Lineweaver-Burk calculatae sunt, quod reciprocum celeritatis reactionis pro functione concentrationis substrati depingit. Constantes cineticae ex diagramma Lineweaver-Burk per programmata GraphPad Prism versione 6.01 calculatae sunt.
Postquam mala aqua fontana diligenter lota sunt, in duas partes divisa et suco expresso machina automatica Braun MP80 (in Germania fabricata) expresso sunt. Sucus per quattuor stratas panni casearii filtratus est. Nulla enzyma coetui comparationis addita sunt, dum 2.0% laccasi (efficacissima concentratio probata) suco pomorum recens parato addita est, qui deinde ad 4°C per duas hebdomades conservatus est.
Aciditas titrabilis (TA) et pH determinatae sunt secundum methodum Boulton et al.al.27pH cuiusque exempli mensuratum est pH-metro digitali (JENWAY 3510 pH-metrum). Aciditas titrabilis (TA) secundum acidum malicum hac formula computata est.
Ubi V et C sunt volumen (mL) et concentratio (0.1 mol/L) solutionis natrii hydroxidi in titratione adhibitae, respective. K est coefficiens conversionis acidi malici, aequalis 0.067, et W est massa (g) succi pomorum.
Summa solidorum solubilium (TDSContentum ) omnium exemplorum succi determinatum est refractometro portatili PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Iaponia). Post singulas mensuras, lens optica aqua deionizata abluta est, et singula exempla succi mali ter examinata sunt. Valor cuiusque exempli calculatus est per mediam trium mensurarum. Media ± deviatio standardis pro singulis exemplis succi mali etiam per mediam horum resultatorum calculata est.
Viscoelasticitas exemplorum suci pomorum viscosimetro rotatorio (RV, Rheotest 2, Germania) aestimata est. Exemplum intra cylindrum "S2" viscosimetri collocatum est. Viscositas apparens per inclinationem curvae tensionis scissoriae contra celeritatem scissoriae repraesentata est, quae ex tensione scissoria et curvis correspondentibus ad varias celeritates scissoriae (ab 1.00 ad 437.4 s⁻¹) calculata est. Formula ad viscositatem apparentem calculandam haec est:
Ubi η est viscositas apparens (cP), τ est tensio decurtatoria (dyn/cm²), γ est celeritas decurtatoria (sec⁻¹), et (τ) computatur utens valoribus torsionis (α) et cylindri (Z) formula sequenti adhibita: τ = Z . α.
Index fuscescentis secundum methodum Meidav et ... determinatus est.al.29Exemplum suci decem ml centrifugatum est ad 2750 xg per decem minuta. Quinque ml supernatantis suci mixti sunt cum quinque ml ethanoli 95% mixti. Absorptio mixturae mensurata est ad 420 nm spectrophotometro Shimadzu UV (UV-1601 PC).
Summa phenolica (TPC) colorimetrice determinata est, reagente Folin-Ciocalteu ut a Boulton et al. descriptum est.[XXVII]]. Curva norma acidi gallici constructa est pro concentrationibus ab 0 ad 500 mg/L (r²= 0.997). Resultata exprimuntur ut aequivalentes acidi gallici (mg GAE/mL).
Adde 125 μL aquae destillatae et 2850 μL solutionis FRAP ad 25 μL suci mali et mixturam in tenebris relinque per...30min. Deinde absorptionem ad 593 nm metire utens spectrophotometro Shimadzu UV (UV-1601 PC). Reagens FRAP paratum est miscendo 300 mM solutionis acetatae tamponis (pH 3.6), 20 mM ferri(III) chloridi, et 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazinae (TPTZ) (dissolutae in 40 mM HCl) in proportione 10:1:1. Curva norma generata est utens Trolox ut norma (R²= 0.999), et eventus exprimuntur ut μM Trolox/mL.
Actio antioxidantis succorum tractatorum et non tractatorum per methodum DPPH determinata est ad facultatem eorum radicales liberos DPPH absorbendi aestimandam.31Decem microlitra suci cum 1 ml solutionis DPPH (100 μM) in methanolo mixta sunt. Post reactionem in tenebris per 30 min, absorptio mixturae ad 517 nm spectrophotometro Shimadzu UV (UV-1601 PC) mensurata est. Resultata expressa sunt ut aequivalentes trolox (μM trolox/ml) secundum curvam calibrationis (...).R2(= 0.990).
Data obtenta demonstraverunt maximam productionem laccase in fungis ostreatis NRC 620 observatam esse ante finem diei duodevicesimi fermentationis, activitatem 1302 U/L attingens. Hoc fundamentum fuit ad tempus optimum culturae pro productione laccase determinandum (Figura 1). Quamquam productio enzymi cum crescente tempore culturae aucta est, ratio incrementi non directe proportionalis erat tempori culturae; post dies 21, activitas enzymi tantum 90 U/L aucta erat (ad 1390 U/L). Ergo, dies 18 tandem electi sunt ut tempus culturae optimum ad aequilibrandum proventum producti cum commodis oeconomicis temporis culturae aucti.
Effectus temporis culturae in proventum laccase in Pleuroto ostreato NRC 620. Tres frusta mycelii fungorum (12 mm) in 50 ml medii sterilis inoculata sunt et deinde ad 28°C per tempora diversa culta.
Congruentes cum aliis studiis, nostrae conclusiones indicant tempus culturae ideale ad maximam secretionem laccasis a fungis assequendam inter dies septem et triginta sex verisimiliter esse.32Secundum Ezike et alios.33*Trametes polyzona* WRF03 maximam laccasis quantitatem ante finem noni diei fermentationis produxit, cum activitate specifica 1637 U/mg proteini. Praeterea, Othman et al.34Invenerunt *Trichoderma harzianum* S7113 magnam laccasis copiam quinto die culturae secretisse. Laccasis productionis summam activitatem die quarto decimo attigit, deinde gradatim decrevit.34Quamquam secretio enzymorum etiam per principalem accretionis stadium fieri potest, plerumque per intermediam stadium culmen attingit et consumptione carbonis vel nitrogenii fontis incitatur.34,35
Quamquam laccasum ex Pleuroto ostreato NRC 620 magnam activitatem per latum ambitum temperaturarum ab 50°C ad 80°C exhibuit, prope culmen activitatis (69–98%), maxima eius activitas ad 70°C observata est (Fig. 2a). Extra hoc ambitum temperaturarum, activitas enzymi ad circiter 70°C decrevit. Haec eventa suggerunt enzymum ad altas temperaturas activum esse, probabiliter quia alta temperatura energiam cineticam reactionis auget.
Effectus temperaturae reactionis (a) et pH (b) in actionem laccasis in *Pleuroto ostreato* NRC 620. Temperaturae ab 20 ad 90°C variabiles consecutae sunt per praeincubationem mixturae ad varias temperaturas per 5 minuta antequam enzymum adderetur et reactio inciperetur. Effectus pH in actionem laccasis aestimatus est utens ABTS ut substrato in solutionibus continentibus 0.1 M citratum-phosphatum tamponem per pH variabilem ab 2.5 ad 7.0.
Secundum Ezike etal.33, temperatura optima pro *Trametes polyzona* WRF03 laccase est 55°C, quae eadem est ac pro *Ganoderma lucidum*.laccase36et similis temperaturae optimae (50°C) pro *Trametes polyzona* KU-RNW02737.laccasa . Baldrian38animadvertit, sicut in aliis systematibus enzymaticis lignin degradantibus, temperaturam idealem pro laccase inter 50 et 70°C esse.
Eventus demonstraverunt enzymum maximam activitatem ad pH 3.0 exhibuisse, 94% activitatis ad pH 3.5 attingens. Attamen, activum mansit per latum pH intervallum a 2.5 ad 7.0 (Figura 2b). Praeterea, maiorem activitatem in condicionibus acidis exhibuit comparatum cum condicionibus neutris vel alcalinis. Eius activitas saltem 77% per intervallum pH a 2.5 ad 4.5 mansit, sed tantum circiter 38% ad pH 7.0 attigit. pH optimum laccasis ex *Trametes polyzona* WRF03 erat 4.533, quod idem est ac pH laccasis ex *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, et *Trametes hirsuta* 41. Attamen, secundum studium a Chairin et al. factum...42, pH optimus laccasi ex *Polymorpha f. sp.* WR710-1 est 2.2, dum pH optimus laccasi ex *Polymorpha f. sp.* IBL-04 est 5.043. Ligatio anionum hydroxidi (inhibitor laccasi) cum atomis cupri laccasi T2/T3 causa esse potest activitatis laccasi imminutae sub condicionibus pH neutris vel alcalinis. Hoc translationem internam electronum a centro T1 ad centrum T2/T3 perturbare potest, ita...limitansactivitas enzymatica23,44
Incubatione enzymi variis temperaturis sublata, inventum est et tempus incubationis et temperaturam stabilitatem enzymi afficere. Notandum est laccasem ex *Trametes polyzona* NRC 620 maiorem stabilitatem sub 40℃ et 50℃ exhibuit, 68.33% et 59.61% activitatis suae initialis respective post 120 minuta retinens (Figura 3a). Contra, sub iisdem condicionibus (40℃ et 50℃, 120 minuta), laccasem ex *Trametes polyzona* WRF03 64.38% et 42.92% activitatis suae respective retinuit.33Contra, tempore incubationis et temperatura crescentibus stabilitatem laccasis *Trametes polyzona* NRC 620 imminuta est; post incubationem ad 60℃ et 70℃ per 60 minuta, activitas eius ad 39.24% et 1.72% respective decrevit (Figura 3a). Congruenter cum resultatis experimentalibus, laccasa ex *Trametes polyzona* WRF03 maiorem stabilitatem ad 40 et 50℃ per totum processum curationis thermalis ostendit.33Similiter, Lueangjaroenkit etal.37et Chairinum et al.al.42stabilitatem laccasarum ex *Trametes polyzonae* KURNW027 et *Trametes polyzonae* WR710-1 ad 50°C per horam unam respective rettulerunt. Ut biocatalysator utilis in variis campis biotechnologicis applicabilis, laccasa bonam stabilitatem et efficaciam per latum ambitum temperaturarum habere debet.
Stabilitas thermostatica (a) et stabilitas pH (b) laccasis ex *Pleuroto ostreato* NRC 620. Stabilitas thermostatica aestimata est incubando solutionem enzymi in 0.05 M solutione phosphatis natrii tamponis (pH 7.0) ad 40, 50, 60, et 70°C per 2 horas, respective. Stabilitas pH aestimata est incubando solutionem enzymi in 0.1 M solutione citrati tamponis et solutione Tris tamponis (pH 3, 4, 6, et 7) ad 40°C per 2 horas. Actio residua calculata est utens ABTS ut substrato post incubationem.
Ad optimas condiciones usus et conservationis enzymorum determinandas, effectum pH in stabilitatem laccasis investigavimus. Expositio variis valoribus pH stabilitatem structurae proteini significanter affecit, ita stabilitatem et actionem moleculae enzymi afficiens. Resultata demonstraverunt enzymum minus stabile esse sub condicionibus acidis, dum meliorem stabilitatem demonstravit ad valores pH altiores (regiones neutras et alcalinas). Ad valores pH 7.0, 6.0, 4.0, et 3.0, rationes retentionis enzymi post 120 minuta erant circiter 100%, 62.54%, 52.39%, et 11.14% respective (Fig. 3b). Laccasis *Strombus multitus* WRF03 maiorem stabilitatem ad valores pH neutros (5.5–6.5) et minorem stabilitatem ad valores pH acidos (infra 4.0) ostendit. Post 120 minuta ad valores pH 5.5, 6.0, et 6.5, rationes retentionis enzymi erant circiter 82%, 100%, et 93% respective.33Khairin et alii.42animadverterunt laccasem ex Trametes polyzona WR710-1 stabilem fuisse in intervallo pH 6.0 ad 7.0, dum Sayed et al.45Demonstratum est laccasem stabiliorem esse sub condicionibus pH neutris. Attamen laccasem ex *Cerrena unicolor* etiam stabilitatem exhibuit sub condicionibus alcalinis (pH 9.0).46Laccasae investigatae stabilitatem magnam per latum pH ambitum demonstraverunt. Haec proprietas magni momenti ad usus industriales esse potest.
Cum nonnulli iones metallici effectus et stimulatorios et inhibitorios in actionem enzymaticam habeant, effectus eorum in actionem enzymaticam in applicationibus industrialibus considerandi sunt. Hoc magni momenti est quia iones metallici sunt contaminantes ambientales communes qui stabilitatem et synthesim enzymorum extracellularium afficere possunt.47Ad investigandos effectus plurium ionum metallicorum in laccasem ex *Pleuroto ostreato* NRC 620, experimenta congruentia perfecimus. Ut in Figura 4 demonstratur, pro genere metalli adhibito, augmentum concentrationis ionum metallicorum a 2.5 mM ad 10 mM functionem enzymi negative affecit. Exempli gratia,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, etCu²⁺actionem enzymaticam incitare et activare posset, dumNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, etK⁺actionem enzymi inhibere potuit. Concentratione 10 mM, iones Cu²⁺ et Mg²⁺ activatores potentissimi actionis laccasae ex *Pleuroto ostreato* NRC 620 fuerunt, gradum activationis circiter 34% et 20% respective praebentes. Attamen, concentratione 10 mM, iones Ca²⁺ inhibitores potentissimi laccasae fuerunt, actionem enzymi circiter 60% reducentes.
Effectus ionum metallicorum in activitatem laccasis Pleurotus ostreati NRC 620. Laccasa per decem minuta in solutione phosphatis natrii tamponata (0.05 M, pH 7.0) continente varia iona metallica concentrationibus 2.5 mM et 10 mM incubata est. Deinde reactio initiata est additione substrati (ABTS), post quod activitas relativa mensurata est.
Nostrae conclusiones congruunt cum conclusionibus aliorum auctorum qui invenerunt Mg²⁺ et Cu²⁺ activitatem *Trametes polyzonae* WRF03³ augere. Castaño et al.⁴⁸ invenerunt laccasem ex *Xylaria* sp. quodammodo a ionibus cupri (Cu²⁺) stimulari. Praeterea, Foroutanfar et al.⁴⁹ et Si et al.⁵⁰ similia studia de laccasis ex *Paraconiothyrium variabile* et *Trametes pubescens*, respective, perfecerunt. Locus ligationis cupri typi II (T2) huius enzymi Cu²⁺ saturari potest ad datam concentrationem, quod stimulationem activitatis laccasis ad altiores concentrationes Cu²⁺³⁹ explicare potest. Cum laccasae fungorum putredinis albae sint oxidasae continentes plures atomos cupri, effectus ionum cupri in activitatem laccasarum varii sunt et variant a stimulantibus et inhibitoribus ad neutrum.⁵¹ Contra, Zhou et al.[52]nuntiatum estCu²⁺actionem laccasarum termitis subterraneae Taiwanensis (Odontotermes formosani) inhibuit. Attamen, laccasae Cerenae sp. HYB07[53]et Clitocybe maxima[54]a ionibus cupri non affectae sunt.
Specificitas substrati per eius parametros cineticos (Km et Vmax) repraesentata est; quo fortior affinitas ligationis substrati ad enzymum, eo minor valor Km et eo maior specificitas substrati.3, 21, 55Parametri cinetici (Km et Vmax) laccasis ex *Pleuroto ostreato* NRC 620 determinati sunt per programmatum GraphPad Prism 6.0, delineando diagramma Lineweaver-Burk (Figura 5). Cum ABTS ut substratum adhibitum est, eventus fuerunt 1.99 mM et 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹respective. Elsayed et alii.21rettulerunt valores Km pro oxidatione ABTS fuisse 0.1 mM et 0.064 mM respective, indicantes magnam affinitatem isoenzymorum Lac A et Lac B pro ABTS. Praeterea, valores Vmax erant 0.182 μmolmin⁻¹et 0.603 μmolmin⁻¹, respective. Valor Km inventus minor erat quam valor Trametis polyzonae WRF03 (8.66 mM); praeterea, valor Vmax eorum (1429 mmol min⁻¹) etiam erat.inferiorcum ABTS ut substratum adhibeatur.33 Similiter, valores Km concentrationum laccasarum Lentinus squarrosulus MR13 et Trametes sp. AH28-2 erant 0.0714 mM et 0.025 mM respective, et valores Vmax erant 0.0091 mM min⁻¹ et 0.67 mM min⁻¹ mg⁻¹ (relative ad ABTS)., respective.56,57
Effectus concentrationis ABTS in activitatem laccasis ex *Pleuroto ostreato* NRC 620 investigatus est, et diagramma Lineweaver-Burk reciproci velocitatis reactionis initialis contra concentrationem ABTS delineatum est. Reactio oxidationis ABTS cum diversis concentrationibus (0.025–3.0 mM) laccasis ad pH 4.5 mensurata est ad parametros cineticos (Vmax et Km) determinandos. Constantes cineticae Michaelis-Menten computatae sunt utens diagramma Lineweaver-Burk reciproci velocitatis reactionis contra concentrationem substrati. Constantes cineticae calculatae sunt ex diagramma Lineweaver-Burk utens programmate GraphPad Prism 6.01.
Enzyma clarificantia tradita, ut pectinasa, substantias pecticas hydrolyzant, viscositatem et turbiditatem minuentes. Polysaccharida structuralia efficaciter dissolvunt et saepe cum aliis enzymis, ut cellulasis et hemicellulasis, ad proventum et claritatem augendam adhibentur. Attamen pectinasae composita phenolica non specifice petunt, quae praecipue turbiditatis et fuscescentiae oxidativae contribuunt, praesertim in succis ut pomi et uvae.58Contra, laccasae oxidationem compositorum phenolicorum catalyzant, ea in moleculas maiores, insolubiles, polymerizantes, quae sedimentatione vel filtratione removeri possunt. Hic mechanismus non solum claritatem auget, sed etiam tempus conservationis suci extendit, probabilitatem fuscescendi oxidativi a compositis phenolicis causati minuendo. Praeterea, processus clarificationis laccasis fundati sub condicionibus mitibus processus (pH 3.5–5.5, temperatura 25–40°C) perfici possunt, ita ut idonei sint ad succos delicatos sine detrimento proprietatum nutritionalium vel organolepticarum.59Studia demonstraverunt curationem pectinasi succum intra 1-2 horas clarificare posse, dum curationem laccasi plerumque longius tempus reactionis (3-6 horas) requirere ad composita phenolica plene reducenda. Attamen, hic processus optimizari potest per immobilizationem enzymi vel per combinationem laccasi cum methodis mechanicis clarificationis.60In hoc studio, delineatio enzymatica extracti crudi significantes actiones laccasis et α-amylase ostendit, dum actiones pectinasis et xylanasis valde humiles erant, et activitas cellulasis non detecta est. Ergo, reductio turbiditatis et contenti phenolici maxime actioni laccasis debetur, dum mutatio viscositatis partim actioni amylasis deberi potest.
Tabula 1 parametra physicochemica succi mali recens expressi et exemplorum laccase tractatorum ostendit. Resultata demonstraverunt proventum succi mali recens expressi (71.59%) inferiorem fuisse quam exemplorum laccase tractatorum (87.34%). Haec resultata congruunt cum inventis Pilnik et Orange.61...qui indicaverunt usum enzymorum in processu fructuum posse augere suci proventum, filtrationem emendare, et succum clarum et altae qualitatis ad concentrationem obtinere. Incrementum proventus suci praecipue debetur incremento contenti saccharorum solubilium in suco. Per hydrolysin enzymaticam fructuum, mesoglea et pectinum in parietibus cellularum producti destruuntur et in substantias solubiles, ut saccharum et acida neutra, convertuntur.LXII.Valor pH suci mali enzymo tractati significanter inferior erat quam eius coetus testigo (P < 0.05), et valor pH utriusque coetus per conservationem significanter auctus est (Tabula 1). Haec resultata congruunt cum iis quae Mark et al. assecuti sunt.63...qui animadverterunt pH suci fructus anacardii post conservationem, post curationem caloris, decrevisse. Degradatio pectini et formatio acidi galacturonici post curationem enzymaticam fortasse causam augmenti pH per conservationem praebent. pH exemplorum enzymatice tractatorum inter 4.05 et 4.31 per totam conservationem mansit, dum pH suci mali non tractati inter 4.12 et 4.33 variabat.
Aciditas totalis (TA) exemplorum tam non tractatorum quam laccase tractatorum decrescere ostendit cum crescente tempore repositionis (Tabula 1). Diminutio aciditatis attributa est conversioni acidorum organicorum in carbohydrata vel reactionibus enzymaticis, necnon oxidationi durante repositione suci.64Aciditas totalis suci mali comparativi et exemplorum enzymis tractatorum inferior erat quam aliorum succorum (suci fragariae 0.9%, succi pruni 2.2%, succi kumquat 1.0%, succi Armeniacae 2.4%, succi aurantii 0.8%), sed similis ac aliorum succorum (e.g., succi piri 0.3%).62Hae differentiae in suco pomorum recens expresso non tractato variis factoribus, ut condicionibus crescentibus, factoribus geneticis, gradu maturitatis, et methodis processus, oriri possunt.65Diminutio aciditatis totalis suci pomorum controlli et laccase tractati congruit cum resultatis a Singh et al. propositis.66De diminutione aciditatis totalis suci mali Jin Nuo post 74 dies repositionis. Contra, Oshmiansky et Wojdylo67Nullas mutationes significantes in aciditate succi pomorum invenerunt cum effectum methodorum clarificationis traditarum studuerunt.
Resultata in Tabula 1 exhibita indicant valorem solidorum solubilium totalium (TSS) suci mali laccase tractati maiorem fuisse quam valorem exempli non tractati. Haec resultata congruunt cum studiis editis.. 68Praeterea, Tabula 1 ostendit valorem TSS gregis suci mali comparativi 9.58 fuisse tempore initiali et 11.05 attigisse ante finem temporis repositionis. Hi valores inferiores sunt quam valores TSS suci mali recentis a Hamid et al. relati.. 69(11.2 et 11.80, respective). Valor summae substantiae solubilis (TSS) exemplorum suci mali laccase tractatorum significanter auctus est, ab 11.23 incipiens et ad 12.93 perveniens post duas hebdomades repositionis ad 4°C (Tabula 1). Simile incrementum TSS per repositionem etiam in citris, limonibus, et aurantiis dulcibus observatum est. Incrementum solidorum totalium solubilium (TSS) per repositionem fortasse ex hydrolysi polysaccharidorum (amyli) ad monosaccharida (sacchara), incremento concentrationis propter dehydrationem suci, et degradatione pectini in suco ad solida solubilia oritur. Incrementum solidorum totalium solubilium (TSS) probabiliter ex incrementum saccharorum solubilium oritur, quae per conversionem pectini vel cellulosae in sacchara solubilia per pectinum vel cellulasam, respective, vel per hydrolysi amyli in sacchara formari possunt, ut Hamed et al. rettulerunt.LXIX.Effectus laccasae in proprietates suci mali visualiter observari potest, cum succus mali laccasa tractatus meliorem fluiditatem et minorem viscositatem quam succus non tractatus exhibeat. Haec observatio in Tabula 1 notatur; Viscositas exempli enzymo tractati 1.87 cP erat, dum viscositas exempli comparativi 2.95 cP erat. Haec significans viscositatis diminutio probabiliter debetur maiori capacitati aquae tenendae substantiarum pectino similium et formationi structurae cohaerentis reticulatae.
In hoc studio, effectus laccasi in indicem fuscescendi (BI) suci mali investigatus est per mensurationem absorptionis ad 420 nm spectrophotometro utens. Resultata in Tabula 1 monstrantur. Per conservationem, BI exemplorum suci mali in gregibus tam tractatis quam non tractatis gradatim crescere ostendit. BI gradum fuscescendi reflectit et ut...magni momentiindex reactionum fuscescentium enzymaticarum et non-enzymaticarum. Absorptio per conservationem significanter aucta est (P < 0.05). Fine conservationis,A420Valor exemplorum suci pomorum in gregibus comparativis et enzymo tractatis auctus est circiter 217% et 121% respective (Tabula 1). Resultata indicant curationem enzymaticam posse efficaciter gradum fuscescendi circiter 56% reducere. Resultata Bezerrae et al.[19]] cum nostris eventibus congruunt; Laccasum-glutaraldehydum-fibram cocois ad succum pomorum clarificandum adhibuerunt, colorem eius originalem 61% reducentes.
Quamquam polyphenola in succis fructuum effectus positivos nutritionales et therapeuticos in corpus humanum habent, etiam cum proteinis reagere possunt, nebulositatem, sedimentationem, vel turbiditatem suci causantes, ita saporem et odorem producti alterantes et eius tempus conservationis imminuentes.71Propositum huius studii erat contentum compositorum phenolicorum in suco mali tuto reducere, laccase ex *Pleuroto ostreato NRC 620* utens. Resultata in Tabula 1 exhibita ostendunt contentum totale compositorum phenolicorum in suco mali laccase tractato significanter redactum esse ante conservationem ad 4°C. Praeterea, contentum totale compositorum phenolicorum etiam per conservationem in ambobus exemplaribus studiatis decrevit (Tabula 1). Investigatio a Sandri et al. facta...72demonstraverunt succum pomorum enzymis tractatum posse retinere suam vim antioxidantem et contentum compositorum phenolicorum. Attamen, eventus studii a Lettera et al. facti.73demonstrant tractationem suci aurantiorum cum laccasa fungali contentum compositorum phenolicorum in eo usque ad 45% reducere posse.
Composita phenolica proprietates tales ut elutionem radicalium liberorum, reductionem et extinctionem oxygenii singularis, translationem atomorum hydrogenii, et donationem electronum radicalibus liberis habere demonstrata sunt, quae ea antioxidantia potentes reddunt.74Quapropter, in hoc studio, methodi DPPH et FRAP fundatae adhibitae sunt ad effectum laccase in activitatem antioxidantem suci mali in armario frigidario per quattuordecim dies conditi aestimandum (Tabula 2). Ambae methodi augmentum activitatis antioxidantis per conservationem demonstraverunt, quod fortasse ob augmentum compositorum phenolicorum liberorum vel formationem productorum reactionis Maillard (MRP) oritur, cum producta reactionis Maillard verisimiliter causa augmenti activitatis antioxidantis sint.75Reactiones fuscescentiae non enzymaticae (inter quas degradatio acidi ascorbici, reactiones Maillard, et degradatio saccharorum acido catalysata) pigmenta fusca (melanoidina) producunt. Producta degradationis acidi ascorbici intermedia et producta degradationis sacchari (ut composita carbonylica) cum aminoacidis per reactiones Maillard reagere possunt.76Quamquam fuscescentia fructuum et olerum per repositionem late investigata est, nostra intellectus harum reactionum adhuc limitata manet.77Comparatus cum methodo FRAP, succus pomorum laccase tractatus significanter minorem actionem antioxidantem per methodum DPPH ostendit (Tabula 2), et actio antioxidantis omnium exemplorum significanter aucta est cum crescente tempore repositionis. Duae methodi diversae ad actionem antioxidantem determinandam in hoc studio adhibitae sunt quia principia earum differunt. Methodus DPPH facultatem neutralizandi radicales liberos metitur, dum methodus FRAP facultatem reducendi iones ferri metitur. Quapropter, commendatur ut multiplices methodi ad actionem antioxidantem determinandam adhibeantur ad melius intellegendam actionem antioxidantem exemplorum studiatorum.78
Unum ex praecipuis inventis huius studii est quod laccasa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 optimam actionem exhibet ad 70°C et pH 3.0. Comparata cum aliis laccasis fungalibus vulgo ad clarificationem sucorum adhibitis, ut puta laccasis *Trametes versicolor* et *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 maiorem stabilitatem thermalem et pH acidiorem exhibet. Laccasae ex *Trametes versicolor* et *Ganoderma lucidum* typice optimam actionem exhibent in intervallo 50-60°C et ad valores pH inter 3.5 et 5.0. Haec differentia ad meliorem efficaciam clarificationis sucorum conferre potest, praesertim pro succis acidis ubi stabilitas ad valores pH inferiores critica est. Proprietas singularis *P.* Comparata cum aliis laccasis fungalibus investigatis, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 facultatem ostendit efficaciter fungendi sub condicionibus difficilioribus. Temperatura actionis optimae altior commoda potentialia in applicationibus industrialibus suggerit, ut celeriores reactionis celeritates et contaminationem microbialem reductam. pH eius humile, quod naturae acidae multorum succorum bene convenit, utile esse potest in processibus clarificationis succorum. Haec eventa explorationem ulteriorem applicationis magnae scalae iustificant, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 alternativam viabilem fontibus laccasis fungalibus traditis facientes. Comparatis studiis prioribus, invenimus temperaturam optimam esse 60°C et pH optimum esse 3.0. Post reactionem ad 60°C per 80 minuta, laccasis *Ganoderma lucidum* retenta est.46% actionis suae.79 Secundum Kurniawati et Nicelle80Enzyma *Ganodermae lucidum* stabilitatem excellentem ad moderatam exhibent ad 25°C et valores pH ab 5.0 ad 8.0 variantes, et stabilitatem ad pH 6.0 et temperaturas ab 10 ad 30°C variantes. In hoc studio, invenimus pH et temperaturam optimam pro activitate enzymatica pro *Pleuroto ostreato* fuisse 3.0 et 70°C respective. Post incubationem ad 40°C et 50°C per duas horas, enzymum 68.33% et 59.61% activitatis suae respective retinuit. Praeterea, laccasa Pleuroti ostreati NRC 620 magnam activitatem exhibuit per latum intervallum temperaturarum ab 50°C ad 80°C, fere maximam activitatem (69%–98%) attingens, maxima activitate ad 70°C observata.
In conclusione, laccasum fungorum ostreae NRC620, sub condicionibus staticis obtentum, optimam activitatem et stabilitatem per varias condiciones pH et temperaturae demonstravit, stabilitatem superiorem comparatam cum aliis fontibus enzymorum ostendens. Additio 10 mM MgSO₄ et CuSO₄ activitatem enzymi circiter 21% et 35% respective auxit. Cum in succum mali confectum est, enzymum pH et viscositatem minuit, dum contentum phenolicum paulum tantum per conservationem decrevit.
Eventus potentiam laccasae in industria alimentaria, praesertim in clarificatione potionum, confirmant. Per dissolutionem specificam compositorum phenolicorum, laccasa non solum turbiditatem minuit et claritatem auget, sed etiam qualitatem succorum fructuum sub lenibus condicionibus operationis conservat. Dissimilis agentibus clarificantibus traditis, ut gelatina, bentonita, et gel silicae, laccasa non generat sordes nec odores gratos a potionibus tollit, eam optionem magis amicam ambienti et sustinibilem reddens. Praeterea, comparata cum aliis enzymis et methodis filtrationis, laccasa solutionem directam et sumptibus efficientem offert, sine qualitate producti detrimento.
Kyomuhimbo, HD et Brink, HG. Applicationes et rationes immobilizationis laccasarum cupro continentium; recensio. Heliyon 9, e13156 (2023).
Tempus publicationis: XV Kalendas Ianuarias, anno MMXXXV